Isolation, Amplifikation, Sequenzierung und Analyse von extrachromosomaler zirkulärer DNA (eccDNA) des Beta vulgaris-Genoms
Research output: Types of Thesis › Master thesis
Contributors
Abstract
Als extrachromosomale zirkuläre DNA (eccDNA) werden ringförmige DNA-Struk-
turen bezeichnet, welche physisch getrennt von den Chromosomen vorliegen. Auch wenn diese bereits seit fünf Jahrzehnten bekannt sind, sind sie aktuell wieder Gegenstand vieler Studien. Die Motivationen zur Untersuchung von eccDNAs sind ebenso vielfältig, wie die vermutlich mit ihnen assoziierten Funktionen. Sie spielen in humanen Zellen Rollen in der Genomregulation, Alterungsprozessen oder auch Krebsentwicklung. In Pflanzen sind die Funktionen der eccDNA weitgehend unbekannt. Aktuelle Publikationen bringen sie jedoch immer wieder in Zusammenhang mit regulativen Eigenschaften, Adaption und möglicherweise auch evolutiven Prozessen. Ebenfalls sehr vielfältig diskutiert sind die Bildungsmechanismen der eccDNA. Bekannt ist dabei, dass sie unter anderem durch die Rekombination von Sequenzwiederholungen entstehen können. Daher befinden sich in den eccDNA-Fraktionen verschiedener Organismen auch Sequenzen von aktiven LTR-Retrotransposon und tandemartig repetitiven DNAs. Motiviert durch das vielfältige Potential der eccDNA wurden im Rahmen dieser Arbeit diese DNA-Fraktionen aus Beta vulgaris subsp. vulgaris isoliert, amplifiziert, anschließend durch molekularbiologische Methoden analysiert und mittels Illumina-Technik sequenziert. Die erzeugten Sequenzdaten wurden mit Hilfe von drei verschiedenen Ansätzen an hier etablierten, bioinformatischen Routinen untersucht und der Einfluss von Gewebetypen bzw. (epigenetischem) Stress auf die Zusammensetzung der eccDNA-Fraktionen festgestellt. Mittels der bioinformatischen Untersuchungen konnten sowohl in Infloreszenzen als auch in Blattmaterial von zebularinbehandelten B. vulgaris-Pflanzen drei mitochondriale Minizirkel als Hauptteil der eccDNA-Fraktion detektiert werden. Diese wurden in Form von eccDNA-Amplikons auch experimentell mittels diagnostischer PCR-Analysen verifiziert. Ebenfalls an diesem Material wurden Expressionsanalysen mittels RT-PCR und Northern-Blot Hybridisierungen durchgeführt, welche Hinweise auf aktive Ty1/copia-LTR-Retrotransposons lieferten. Da es sich methodisch um einen Anreicherung von eccDNA aus genomischer DNA handelt, konnten während dieser Arbeit vor allem die hoch abundanten Bestandteile der eccDNA in den genannten Sequenzdatensätzen und Experimenten nachgewiesen werden. Jedoch zeigten sich die angewandten Methoden und etablierten bioinformatischen Routinen als eine solide Grundlage zur effizienten Detektion von eccDNA-Kandidaten in weiteren Geweben von B. vulgaris oder anderen Organismen, ohne eine Referenzgenom-sequenz vorauszusetzen.
turen bezeichnet, welche physisch getrennt von den Chromosomen vorliegen. Auch wenn diese bereits seit fünf Jahrzehnten bekannt sind, sind sie aktuell wieder Gegenstand vieler Studien. Die Motivationen zur Untersuchung von eccDNAs sind ebenso vielfältig, wie die vermutlich mit ihnen assoziierten Funktionen. Sie spielen in humanen Zellen Rollen in der Genomregulation, Alterungsprozessen oder auch Krebsentwicklung. In Pflanzen sind die Funktionen der eccDNA weitgehend unbekannt. Aktuelle Publikationen bringen sie jedoch immer wieder in Zusammenhang mit regulativen Eigenschaften, Adaption und möglicherweise auch evolutiven Prozessen. Ebenfalls sehr vielfältig diskutiert sind die Bildungsmechanismen der eccDNA. Bekannt ist dabei, dass sie unter anderem durch die Rekombination von Sequenzwiederholungen entstehen können. Daher befinden sich in den eccDNA-Fraktionen verschiedener Organismen auch Sequenzen von aktiven LTR-Retrotransposon und tandemartig repetitiven DNAs. Motiviert durch das vielfältige Potential der eccDNA wurden im Rahmen dieser Arbeit diese DNA-Fraktionen aus Beta vulgaris subsp. vulgaris isoliert, amplifiziert, anschließend durch molekularbiologische Methoden analysiert und mittels Illumina-Technik sequenziert. Die erzeugten Sequenzdaten wurden mit Hilfe von drei verschiedenen Ansätzen an hier etablierten, bioinformatischen Routinen untersucht und der Einfluss von Gewebetypen bzw. (epigenetischem) Stress auf die Zusammensetzung der eccDNA-Fraktionen festgestellt. Mittels der bioinformatischen Untersuchungen konnten sowohl in Infloreszenzen als auch in Blattmaterial von zebularinbehandelten B. vulgaris-Pflanzen drei mitochondriale Minizirkel als Hauptteil der eccDNA-Fraktion detektiert werden. Diese wurden in Form von eccDNA-Amplikons auch experimentell mittels diagnostischer PCR-Analysen verifiziert. Ebenfalls an diesem Material wurden Expressionsanalysen mittels RT-PCR und Northern-Blot Hybridisierungen durchgeführt, welche Hinweise auf aktive Ty1/copia-LTR-Retrotransposons lieferten. Da es sich methodisch um einen Anreicherung von eccDNA aus genomischer DNA handelt, konnten während dieser Arbeit vor allem die hoch abundanten Bestandteile der eccDNA in den genannten Sequenzdatensätzen und Experimenten nachgewiesen werden. Jedoch zeigten sich die angewandten Methoden und etablierten bioinformatischen Routinen als eine solide Grundlage zur effizienten Detektion von eccDNA-Kandidaten in weiteren Geweben von B. vulgaris oder anderen Organismen, ohne eine Referenzgenom-sequenz vorauszusetzen.
Details
Original language | German |
---|---|
Qualification level | Master of Science |
Awarding Institution | |
Supervisors/Advisors |
|
Defense Date (Date of certificate) | 15 Jun 2018 |
Publication status | Published - 2018 |
No renderer: customAssociatesEventsRenderPortal,dk.atira.pure.api.shared.model.researchoutput.Thesis
External IDs
ORCID | /0000-0001-8756-8106/work/142240008 |
---|